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蛋白質(zhì)的分離方法,你想知道的都在這里

更新時(shí)間:2020-06-17 點(diǎn)擊次數(shù):11109

蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在,每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),至今還沒的單獨(dú)或一tao現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái),因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。在這里小編就給各位小伙伴說(shuō)道說(shuō)道目前主流的蛋白質(zhì)分離方法。

 

根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

(1)蛋白質(zhì)的鹽析

不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過(guò)調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì),并能再度溶解而不變性。中性鹽(一般為硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉,其中應(yīng)用z多的硫酸銨,它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大,也不易引起變性)對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱鹽溶;當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí),蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現(xiàn)象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4和NH4)有很強(qiáng)的水化力,可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,使之“失水”,于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。

 

鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。

 

影響鹽析的因素有:

(a)溫度:除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶解度降低。但有的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時(shí)溶解度低,更容易鹽析。

(b)pH值:大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶解度低。

(c)蛋白質(zhì)濃度:蛋白質(zhì)濃度高時(shí),欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)(共沉現(xiàn)象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。

蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)(常用的是玻璃紙),用緩沖液進(jìn)行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時(shí)間較長(zhǎng),所以在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡聚糖凝膠TandexG-25F或TandexG-50過(guò)柱的辦法除鹽,所用的時(shí)間就比較短。

 

(2)等電點(diǎn)沉淀法

蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力小,因而溶解度也小,各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別,可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀,但此法很少單獨(dú)使用,可與鹽析法結(jié)合用。

 

(3)低溫有機(jī)溶劑沉淀法

用與水可混溶的有機(jī)溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質(zhì)較易變性,應(yīng)在低溫下進(jìn)行。

 

根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

(1)透析與超濾

透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。

超濾法是利用高壓力或離心力,強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

 

(2)凝膠過(guò)濾法

也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物z有效的方法之一。柱中z常用的填充材料是葡聚糖凝膠(Tandex系列)瓊脂糖凝膠(Tanrose 系列)和瓊葡糖凝膠(SuperTandex pg系列)。

 

根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離方法

(1)電泳法

各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下,因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度,當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí),到達(dá)各自等電點(diǎn)的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

 

(2)離子交換層析法

離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑(如:SP Tanrose 6FF)和陰離子交換劑(Q Tanrose 6FF),當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí),帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強(qiáng)度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。

 

根據(jù)配體特異性的分離方法-親和層析法

親和層析法(Affinity chromatography)

 

分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價(jià)地結(jié)合進(jìn)行分離。它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái),而且純度很高。

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