精品国产第一国产综合精品,欧美iphone,国产一区二区在线视频,调教禁欲奴性禁止自慰杯套男男

服務熱線

021-50276769
網站導航
技術文章
當前位置:主頁 > 技術文章 > 全面解析GST 親和層析

全面解析GST 親和層析

更新時間:2021-12-29 點擊次數:3214

概述


谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)是生物體內的一類重要的代謝酶,參與外源和內源有毒物質的代謝。GST通過催化還原型的谷胱甘肽(GSH)和有毒物質偶聯(lián)反應,使有毒化合物的水溶性增加從而更容易排出體外,最終達到解毒的作用。利用這個原理,將GST做成標簽表達出融合蛋白,與帶谷胱甘肽配基的親和介質特異性結合,從而純化出目標蛋白,再用特異性的酶將GST標簽切除從而得到天然蛋白。

GST標簽

GST標簽是一種常見的標簽,它能夠增加外源蛋白的可溶性,很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性,可在不同的宿主中表達,適應范圍廣,能夠提高外源蛋白的穩(wěn)定性,可用不同的蛋白酶去除且具有高特異性,純化方便、溫和。但它也有一定的缺點,比如分子量較大,可能會影響蛋白質的功能和下游實驗,因此純化后需要去除標簽,并且如果蛋白不可溶,很難用變性的方法純化。

GST親和層析

GST親和層析是利用GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過硫鍵共價結合,通過GSH交換洗脫的原理來進行純化。該純化柱中,凝膠手臂上通過硫鍵結合一個GSH,然后利用其與GST-tag之間酶和底物的特異性作用力,使得帶GST標簽的融合蛋白能夠與凝膠上的GSH結合,從而將標簽蛋白與其他蛋白分離開。

月旭GST親和層析填料


微信截圖_20211229113856.png

GST融合蛋白純化步驟


1.將GST Tanrose 4FF裝入合適的層析柱,層析用5倍柱體積的結合Buffer進行平衡,使填料處于與目的蛋白相同的緩沖體系下,起到保護蛋白的作用。

2.將樣品加到平衡好的GST Tanrose 4FF中(保證目的蛋白與GST Tanrose 4FF充分接觸,提高目的蛋白的回收率),收集流出液。

3.用10-15倍柱體積的洗雜Buffer進行清洗,去除非特異性吸附的雜蛋白,收集洗雜液。

4.使用5-10倍柱體積的洗脫Buffer,收集洗脫液,即目的蛋白組分。

5.依次使用3倍柱體積的結合Buffer和5倍柱體積的去離子水平衡填料,最后再用5倍柱體積的20%的乙醇平衡,然后保存在等體積的20%的乙醇中,置于4度保存,防止填料被細菌污染。

應用實例

層析柱:PreCot 5mL GST 4FF;

樣品:重組表達GST標簽蛋白;

結合緩沖液:20mM PB,150mM NaCl,pH7.4;

洗脫緩沖液:15mM還原型谷胱甘肽,50mM Tris pH8.0。


微信截圖_20211229113944.png

常見問題解答


GST蛋白結合效率低,該怎么辦?

可能原因:上樣流速太快,結合時間太短。

解決方法:降低流速,保證足夠的結合時間

可能原因:緩沖液不合適,柱子平衡不到位。

解決方法:將緩沖液pH控制在3-12之間,用至少5倍的柱體積平衡柱子。

可能原因:樣品中GST融合蛋白濃度太低。

解決方法:先濃縮樣品,再進行純化。

可能原因:GST蛋白發(fā)生變性或聚集。

解決方法:選擇合適的細胞破碎方式;發(fā)生聚集時可嘗試添加1-10mM的DTT促進蛋白溶解;GST蛋白與核酸結合或蛋白之間結合時可添加適量NaCl(100-300mM)。

GST蛋白洗脫困難,該怎么做?

可能原因:洗脫強度不夠。

解決方法:增加洗脫體積數;調整洗脫緩沖液pH(8-9)或離子強度(100-300mM氯化鈉)。

可能原因:非特異性吸附。

解決方法:洗脫緩沖液中加入1%-2%Triton X-100。

可能原因:洗脫緩沖液中的谷胱甘肽被氧化了。

解決方法:洗脫緩沖液需現配現用,也可嘗試加入1-5mM的DTT。

GST蛋白純化后純度太低,該怎么做? 

可能原因:GST融合蛋白降解。

解決方法:加入蛋白酶抑制劑防止降解。

可能原因:在宿主細胞內表達過程中GST標簽脫落。

解決方法:嘗試更換宿主細胞或者優(yōu)化序列。



2025 版權所有 © 月旭科技(上海)股份有限公司  備案號:滬ICP備05030427號-4 GoogleSitemap管理登陸 技術支持:化工儀器網

地址:上海市松江區(qū)明南路85號啟迪漕河涇(中山)科技園紫荊園10號樓 傳真: 郵件:linchen2@welchmat.com

關注我們

服務熱線

掃一掃,關注我們

精品人伦一区二区三区蜜桃免费| 中文字幕一区二区精品区| 三个男人添一个女人下身| 哦┅┅快┅┅用力啊┅┅动态图| 成全视频免费高清观看在线动漫| 五十路六十路老熟妇A片 | 又白又大的奶头a片免费| 一边捏奶头一边啪高潮会怎么样| 欧美性猛交xxxx| 精品一线二线三线区别在哪| 国产大bbwbbwhd视频| 国产女人高潮叫床男人桶到爽| 久久久久亚洲av成人人电影| 欧洲VODAWIFI喷浆3D| 亚洲丰满熟妇xxxx性多毛| 午夜情深深| 精品久久人人爽天天玩人人妻| 人妻女友娇妻沉沦系列| 中文无码亚洲精品制服丝袜| 欧美群妇大交群| 久久久久精品久久久久影院蜜桃| 欧美在线观看| 韩国理论片漂亮的小峓子| a片在线观看| 精品婷婷乱码久久久久久日日| 成熟女人特级毛片WWW免费| 别墅里的肉奴不准穿衣服| 又小又紧女magnet| 欧美精品乱码99久久蜜桃| 精品人伦一区二区三区蜜桃牛牛| 亚洲无av在线中文字幕| 久久久久久精品免费看sss| 三年片在线观看免费观看大全| 亚洲丰满熟女一区二区哦| 五月天中文字幕mv在线| 18禁止进入1000部高潮网站| 亚洲熟女乱综合一区二区| 无码成人精品区在线观看 | 强壮公弄得我次次高潮厨房| 亚洲av无码国产精品永久一区| 蜜臀av无码精品人妻色欲|